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Title: Controle da estabilidade de lotes de staphylococcus aureus e pseudomonas aeruginosa da coleção de microrganismos de referência em vigilância sanitária: CMRVS do INCQS/FIOCRUZ
Advisor: Miranda, Catia Aparecida Chaia de
Clementino, Maysa Beatriz Mandetta
Members of the board: Ferraris, Fausto Klabund
Ferreira, Rafael Lawson
Rosas, Carla de Oliveira
Authors: Reis, Juliana Marques
Coadvisor: Clementino, Maysa Beatriz Mandetta
Moreira, Wildeberg Cál
Affilliation: Fundação Oswaldo Cruz. Instituto Nacional de Controle de Qualidade em Saúde. Rio de Janeiro, RJ, Brasil.
Abstract: Materiais de referência são definidos na ABNT ISO GUIA 30:2011 como materiais suficientemente homogêneos e estáveis com relação a uma ou mais propriedades específicas, estabelecidas, que justificam sua utilização numa medição ou exame qualitativo. São empregados para dar suporte a grandezas e a propriedades qualitativas e, quando certificados, podem ser utilizados no controle da precisão ou na avaliação de métodos de medição. Na área da microbiologia destacam-se os microrganismos de referência que podem ser utilizados no controle de qualidade de análises microbiológicas de produtos e insumos de saúde, como padrões em ensaios de identificação fenotípica e molecular de microrganismos, dentre outras atividades. Estes microrganismos são mantidos e fornecidos por coleções de cultura de referência, como a Coleção de Microrganismos de Referência em Vigilância Sanitária (CMRVS) do INCQS - FIOCRUZ. Na CMRVS as cepas são preservadas, principalmente, pelo processo da liofilização que é um método de preservação capaz de manter a integridade da maioria dos microrganismos por períodos prolongados. Estas cepas são regularmente fornecidas para instituições públicas e privadas e assim, demandam a produção de novos lotes a partir de cepas originais. Os novos lotes devem ser produzidos e preservados sob rigoroso controle de qualidade, a fim de conservar a viabilidade e características bioquímicas, morfológicas e genéticas. Os procedimentos de preparo podem gerar contaminação microbiana e/ou alterações genéticas das culturas que inviabilizam um lote. O objetivo desse estudo foi avaliar onze lotes de Staphylococcus aureus INCQS00039 (ATCC 6538) e dez lotes de Pseudomonas aeruginosa INCQS00025 (ATCC 15442) em relação a viabilidade, pureza, identidade fenotípica e genotípica e autenticidade genética. A viabilidade foi determinada pelo método “Spread Plate” e a identidade fenotípica por provas bioquímicas convencionais e automatizadas (VITEK 2). A identificação genotípica e a autenticidade dos microrganismos de referência ocorreram através da utilização de métodos moleculares, dentre eles: a amplificação dos espaços entre os genes codificadores de tRNA pela PCR (tDNA-PCR), a amplificação dos espaços entre os genes 16S-23S do operon de rRNA (ITS-PCR) e entre as sequências consenso repetitivas de enterobactérias (ERIC-PCR). Dentre os 21 lotes das duas espécies analisadas, cinco não foram viáveis e dentre os lotes que apresentaram crescimento, a concentração de células variou de 1012 a 105 UFC/mL, sendo a maior queda de concentração apresentada por um lote de P. aeruginosa. A identificação automatizada apresentou variações bioquímicas entre o primeiro e o último lote das duas espécies analisadas. Quatro lotes de P. aeruginosa apresentaram colônias com morfologias distintas. No entanto, tanto os lotes com perfis bioquímicos diferentes como aqueles contendo colônias com morfologias diferenciadas apresentaram perfis de bandas idênticos pela tDNA-PCR e ERIC-PCR, descartando a presença de contaminantes. Os resultados obtidos nos permitem concluir que os lotes não viáveis podem ter sofrido efeitos deletérios durante o processo de armazenamento e que as variações das atividades bioquímicas encontradas entre os lotes mais antigos e mais recentes alerta para a necessidade da verificação das características analisadas no estudo. Ainda assim, a maioria dos lotes produzidos pela CMRVS apresentaram condições satisfatórias em relação à identidade, viabilidade e pureza, o que reflete a qualidade do trabalho realizado pela mesma.
Abstract: Reference materials are defined by ABNT ISO GUIA 30:2011 as materials sufficiently homogeneous and stables regarding to one or more specific properties, stablished, that justify the application in a measurement or qualitative exam. They are employed to give support to greatness and qualitative properties and when certificated, can be used in the control of precision or in validation of a measurement method. The highlights in microbiology are reference microorganisms, which can be used in quality control of microbiological analysis of healthy products and inputs, or as patterns in phenotypic and molecular identification assays of microorganisms, among other activities. These microorganisms are maintained and supplied by reference culture collections as the Reference Microorganisms Collection in Sanitary Surveillance (CMRVS) of INCQS – FIOCRUZ. At CMRVS the strains are mainly preserved by the freeze – drying process that is a preservation method able in keeping the integrity of most microorganisms for long periods. They are often supplied to public and private institutions what require the production of new batches from original strains. With this propose, the batches must be made and preserved under rigorous control so as to conserve the viability and the biochemical, morphological and genetics characteristics. The production can lead to microbial contamination and/or genetic changes of the cultures, what derail a batche. The aim of this study was evaluated eleven batches of Staphylococcus aureus INCQS 039 (ATCC 6538) and ten batches of Pseudomonas aeruginosa INCQS 025 (ATCC 15442) in terms of viability, purity, phenotypic and genotypic identity and genetic authenticity. The viability was defined by the Spread Plate method and the phenotypic identity through conventional and automated biochemical (VITEK 2) tests. Genotypic identification and authenticity of reference microorganisms was done by molecular methods, in which: the amplification of spaces between the encoder genes of tRNA by PCR (tDNA PCR), amplification of spaces between 23S and 16S of rRNA operon (ITS-PCR) and between the enterobacterial repetitive intergenic consensus sequence (ERIC-PCR). Among the twenty-one batches of the two-species analyzed, five of them were not viable and among the batches that showed growth, the concentration of cells ranged of 1012 to 105 UFC/mL, and the lowest viability was showed by one batch of P. aeruginosa. Automated identification revealed variations between the first and the last batch produced of each specie analyzed. Four batches of P. aeruginosa exhibited two colonies with distinct morphology. However, both the lots with different biochemical profiles and those with colonies showing distinct morphology produced identical bands profiles by the tDNA-PCR and ERIC-PCR, eliminating the presence of contamination. The results obtained allow us to conclude that: the batches not viable may have suffered negative effects during the storage, the range of the biochemical activity found between the older and newest batches alert to the necessity of verification in the characteristics analyzed in this study. Even so, most of the batches made by CMRVS revealed right conditions with respect to the identity, viability and purity, what reflects the quality of the work done in this place.
Keywords: Reference Microorganisms
Preservation
Identification
keywords: Microrganismos de Referência
Preservação
Identificação
DeCS: Staphylococcus aureus
Pseudomonas aeruginosa
Vigilância Sanitária
Controle de Qualidade
Issue Date: 2017
Citation: REIS, J. M. Controle da estabilidade de lotes de staphylococcus aureus e pseudomonas aeruginosa da coleção de microrganismos de referência em vigilância sanitária: CMRVS do INCQS/FIOCRUZ. 2017. 60 f. Trabalho de Conclusão de Curso (Especialização em Saúde na Área de Vigilância Sanitária com Ênfase na Qualidade)-Instituto Nacional de Controle de Qualidade em Saúde, Fundação Oswaldo Cruz, Rio de Janeiro, 2017.
Date of defense: 2017
Place of defense: Rio de Janeiro/RJ
Department: Coordenação de Pós Graduação
Defense institution: Fundação Oswaldo Cruz. Instituto Nacional de Controle de Qualidade em Saúde
Program: Programa de Pós-Graduação em Vigilância Sanitária
Copyright: open access
Appears in Collections:INCQS - Trabalhos de Conclusão de Curso - Especialização

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