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Title: Aplicação da citometria de fluxo no controle de qualidade de insumos e processos utilizados no desenvolvimento de kits para diagnóstico
Advisor: Almeida, Ana Cristina Martins de Almeida
Members of the board: Amendoeira, Fabio Coelho
De Luca, Paula Mello
Bisaggio, Rodrigo da Cunha
Nogueira, Ana Cristina Martins de Almeida
Santos, Álvaro Luiz Bertho dos
Authors: Santiago, Marta de Almeida
Coadvisor: Santos, Álvaro Luiz Bertho dos
Affilliation: Fundação Oswaldo Cruz. Instituto Nacional de Controle de Qualidade em Saúde. Rio de Janeiro, RJ, Brasil.
Abstract: Ensaios baseados em microesferas tem sido alvo de inúmeros estudos na pesquisa básica e clínica, utilizando como metodologias tanto a citometria de fluxo como a plataforma de microarranjos líquidos. No entanto, ainda existe a necessidade de estudos que visem o desenvolvimento de metodologias de controle de qualidade de insumos e processos empregados nesses ensaios. Desta forma, a presente tese teve como objetivo principal desenvolver métodos aplicando a citometria de fluxo para avaliação de anticorpos ligados a fluorocromos e de processos de acoplamento de anticorpos e/ou antígenos a microesferas. A avaliação dos acoplamentos de anticorpos foi realizada através da citometria de fluxo tradicional e da citometria de fluxo quantitativa (CFQ). Conjugados anti-IgG-PE e anti-HBSAg-PE de diferentes fabricantes e lotes foram acoplados a microesferas e avaliados durante 18 meses. Os resultados mostraram que as melhores condições de acoplamento foram 5 µg/mL de anti-IgG-PE e 1:300 de anti-HBSAg-PE e que houve uma variação entre os lotes e fabricantes dos conjugados tanto na intensidade de fluorescência quanto na estabilidade. A CFQ se mostrou uma ferramenta fundamental para validação dos estudos de estabilidade. A avaliação dos acoplamentos de antígenos às microesferas foi tanto no citômetro de fluxo FACSCalibur quanto no equipamento LX200. Para tal, os diferentes antígenos foram acoplados às microesferas em distintas condições de acoplamento. Os resultados mostraram que a melhor condição de acoplamento foi 2 horas na presença de EDC/NHS. Além disso, todos os antígenos apresentaram uma queda significante da marcação durante os 18 meses de avaliação, sendo essa tendência de queda diferente entre as avaliações feitas nos equipamentos FACSCalibur e LX200. Comparando os resultados dos dois equipamentos, o LX200 apresentou resultados muito mais dispersos que o FACSCalibur. Desta forma, concluímos que a citometria de fluxo pode ser utilizada como uma importante ferramenta de controle de qualidade de insumos e processos utilizados em ensaios de microarranjos líquidos. Além disso, esse protocolo citofluorimétrico pode ser utilizado na avaliação e controle de qualidade de outros conjugados e processos utilizados em outras tecnologias.
Abstract: Bead-based assays have been the focus of numerous studies in basic and clinical research, using flow cytometry as well as liquid microarray platforms. However, studies are needed in order to develop methodologies for quality control of reagents and processes used in these assays. Thus, the present thesis aimed to develop methods using flow cytometry to evaluate monoclonal antibodies bound to fluorochromes and coupling processes of antibodies and/or antigens to beads. The evaluation of antibody coupling to beads was performed by both traditional and quantitative flow cytometry (QFC). Anti-IgG-PE and anti-HBSAg-PE conjugates of different lots and manufacturers were coupled to beads and evaluated for 18 months. The results showed that the best coupling conditions were 5 µg/mL for anti-IgG-PE and 1:300 for anti-HBSAg-PE. There was a difference in the fluorescence intensities and in the stability of different manufactures and lots of conjugates. The CFQ proved to be an essential tool for validation of stability studies. The evaluation of the antigens couplings to beads was carried out using FACSCalibur flow cytometer and the LX200 reader. Different antigens were coupled to the beads using diverse incubation conditions. The results showed that the best coupling condition was 2 hours. In addition, all antigens showed a noteworthy decrease in the staining during the 18-month evaluation. This decrease tendency was different between the LX200 and FACSCalibur analysis. Comparing the fluorescence responses between the two readers, LX200 had more dispersed results than FACSCalibur. Therefore, we concluded that flow cytometry can be used as an important quality control tool for reagents and processes used in bead-based assays. Furthermore, this flow cytometric protocol can be used for evaluation and quality control of other conjugates and processes used in other biotechnologies.
Keywords: Flow Cytometry
MESF
Microarray bead based array
Conjugates
Antigens
Quality Control
keywords: Citometria de Fluxo
MESF
Microarranjos líquidos
Conjugados
Antígenos
Controle de Qualidade
DeCS: Citometria de Fluxo
Controle de Qualidade
Antígenos
Issue Date: 2015
Citation: SANTIAGO, M. A. Aplicação da citometria de fluxo no controle de qualidade de insumos e processos utilizados no desenvolvimento de kits para diagnóstico. 2015. 109 f. Tese (Doutorado em Vigilância Sanitária)-Instituto Nacional de Controle de Qualidade em Saúde, Fundação Oswaldo Cruz, Rio de Janeiro, 2015.
Date of defense: 2015-06-23
Place of defense: Rio de Janeiro/RJ
Department: Coordenação de Pós-Graduação
Defense institution: Fundação Oswaldo Cruz. Instituto Nacional de Controle de Qualidade em Saúde
Program: Programa de Pós-Graduação em Vigilância Sanitária
Copyright: open access
Appears in Collections:INCQS - Teses de Doutorado

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