Ampliação do banco de dados para Bacillus e gêneros relacionados em sistema MALDI-TOF MS para a identificação de microbiota de áreas limpas farmacêuticas

Abstract

Historicamente, a utilização de vacinas tem se mostrado a maneira mais eficaz de prevenção a doenças. Durante o processo de produção de vacinas, rígidas normas devem ser seguidas, a fim de minimizar o risco de contaminação microbiana, logo o programa de monitoramento ambiental deve garantir que as áreas produtivas se mantenham dentro dos níveis de controle adequados. Bacillus e gêneros relacionados pertencem aos principais grupos isolados destes ambientes e a sua identificação é particularmente difícil, devido a similaridades entre espécies estreitamente relacionadas. A maioria dos sistemas de identificação microbiana possuem bases de dados direcionadas para micro-organismos de interesse clínico, o que dificulta a identificação de bactérias de origem ambiental. MALDI-TOF MS se apresenta como uma ferramenta promissora na identificação bacteriana, por ser um método rápido, eficaz e de baixo custo. No entanto, a base de dados (BD) ainda é limitada quanto a bactérias de origem ambiental. Este estudo visa a ampliação da BD do programa Saramis associado a MALDI-TOF MS para a melhoria na identificação de Bacillus e gêneros relacionados provenientes de áreas produtivas de uma unidade produtora de imunobiológicos. Para isso, 97 linhagens deste grupo, isoladas entre 2016 e 2017, foram analisadas inicialmente em sistema VITEK® MS RUO, porém 33 delas não foram identificadas. Após introdução de etapa de préextração com ácido fórmico 70%, este número reduziu para 22. A partir da análise do gene 16S rRNA, os seguintes gêneros foram encontrados: Bacillus (53,3%), Penibacillus (30,4%), Cytobacillus (6,5%), Lysinibacillus (4,3%), Metabacillus, Neobacillus, Oceanobacillus, Terribacillus e Sporosarcina (1,1% para cada gênero). Os resultados foram inconclusivos, quanto ao gênero, para cinco linhagens e 12 linhagens foram apontadas como possíveis novas espécies. Quarenta perfis taxonômicos foram identificados e um representante de cada foi selecionado para a análise dos genes rpoB e gyrB. Após análise filogenética dos três genes, 26 linhagens foram identificadas em nível de espécie, 12 em nível de gênero e duas delas foram consideradas inconclusivas. Após as análises, 32 espectros de massa foram incluídos na BD do programa Saramis, a partir das linhagens isoladas em BioManguinhos e 19 espectros foram inseridos a partir de 21 linhagens isoladas de outras salas limpas e cedidas pela Coleção de Bactérias do Ambiente e Saúde (CBAS/IOC/Fiocruz). Inicialmente, das 97 linhagens analisadas, 77,3% foram identificadas por MALDI-TOF MS (gênero ou espécie). A análise do gene 16S rRNA permitiu a identificação de 94,9% das linhagens. Após a ampliação da BD do programa Saramis, o percentual de identificação subiu de 77,3% para 96,9%, superando o percentual de identificação obtido a partir de metodologia genotípica. Das 21 linhagens cedidas pela CBAS, todas foram indentificadas, sendo que 16 não haviam sido identificadas antes da ampliação da BD. Portanto, a identificação molecular de Bacillus e gêneros relacionados, através do sequenciamento de genes housekeeping e a introdução dos espectros obtidos a partir da análise por MALDITOF MS no programa Saramis, de modo a se obter uma BD customizada, se mostrou uma ferramenta extremamente promissora e eficaz na identificação de Bacillus e gêneros relacionados de origem farmacêutica industrial.