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Title: Isolamento, purificação e caracterização de duas proteínas recombinantes de leishmania chagasi,visando à padronização de um ensaio imunodiagnóstico para leishmaniose canina
Advisor: Silva Júnior, José Godinho da
Nascimento, Hilton Jorge
Members of the board: Senna, José Procópio Moreno
Ano Bom, Cristiane Dinis
Armôa, Geraldo Rodrigues Garcia
Authors: Souza, Cristiane Marques de
Affilliation: Fundação Oswaldo Cruz. Instituto de Tecnologia em Imunobiológicos. Rio de Janeiro, RJ, Brasil / Fundação Oswaldo Cruz. Instituto Oswaldo Cruz. Rio de Janeiro, RJ, Brasil.
Abstract: A leishmaniose visceral (LV) causada pelo parasito Leishmania chagasié uma doença severa que ocorre em seres humanos sendo prevalenteem vários países, inclusive no Brasil. Trata-se da forma com maior potencial de letalidade. Os cães são importantes reservatórios do parasito, portanto o diagnóstico canino é essencialpara os programas de vigilância da LV. Neste trabalho é relatado a expressão, o isolamento e a purificação de dois antígenos recombinantes protéicos de Leishmania chagasi, Lc9 e Lc13, produzidos em Escherichia coli visando um imuno-ensaio para o diagnóstico desta enfermidade. Inicialmente, os plasmídeos de E.coli contendo os gens inseridos e relacionados a ambas as proteínas foram analisados por eletroforese de agarose. A proteína Lc9, por conter um marcador de seis histidinas, foi purificada por cromatografia de metal imobilizado (Ni) seguido porcromatografia de exclusão e peneiração molecular em Superdex 200. A Lc13 foi purificada, somente, por cromatografia de perfusão de troca aniônica em Poros HQ. As preparações protéicas purificadas tiveram suas homogeneidades verificadas por eletroforese desnaturante (SDS-PAGE), focalização isoelétrica e western blot. Um pI estimado de 6,43 e de 6,42 foi observado paraLc9 e Lc13, respectivamente. A determinação de peso molecular (PM) feita por SDS-PAGE-10% indicou valores de 44000 (Lc9) e 88000 (Lc13), enquanto por cromatografia de exclusão e filtração molecular em Superdex 200, os valores estimados foram de 550.000 (Lc9) e 282.000 (Lc13). Estes valores estimados de PM sugerem que ambas macromoléculas apresentam-se em seu estado nativo na forma multimérica, sendo ambas constituídas por cadeias polipeptídicasidênticas. As diferentes detecções protéicas depois do SDS-PAGE de Lc9 e Lc13 purificadas mostraram que a principal banda imuno-revelada corresponde a principal banda revelada como coomassie brilliant blueR-350 por igual metodologia. Concluindo-se então que ambas correspondem ao principal antígeno presente em cada uma das duas preparações protéicas (Lc9 e Lc13) purificadas. Para o desenvolvimento de um ELISA indireto, relacionado ao diagnóstico da leismaniose visceral canina, os antígenos, Lc9 e Lc13 e o conjugado IgG – peroxidase tiveram as faixas de concentrações selecionadas para uso no referido ensaio sorológico. Segundo a mesma metodologia, o antígeno Lc9 apresentou melhores resultados que o antígeno Lc13 (Lc9: sensibilidade 100%; especificidade 95% e Lc13: sensibilidade 96%; especificidade 92%). Os resultados obtidos propõem o uso das proteínas recombinantes Lc9 e Lc13, principalmente a primeira, num imuno-ensaio baseado em ELISA para o aperfeiçoamento do diagnóstico da leishmaniose.
Abstract: The visceral leishmaniasis (VL) caused by Leishmania chagasiis a relevant human disease prevalent in many countries, including Brazil. This form has the greatest potential for lethality. Dogs are important reservoir of the parasite, thus diagnosis of canine infections is essential for VL surveillance programs. This work is related to the expression, isolation and purification of two recombinant protein antigens of Leishmania chagasi, Lc9 and Lc13, produced in Escherichia coliaiming a diagnostic illness immune assay. Initially, the E. coliplasmids containing the inserted genes related to both proteins were analyzed in agarose gel electrophoresis. The protein Lc9 containing a hexapeptide histidine tag was purified by immobilized metal (Ni) affinity chromatography followed by sieving exclusion chromatography in Superdex 200. The Lc13 was only purified by anion exchange perfusion column chromatography onto Poros HQ. The purified protein preparations had their homogeneities ascertained by denaturing gel electrophoresis (SDS-PAGE), isoelectric focusing and western blot. Estimated pI of 6.43 and 6.42 were observed for Lc9and Lc13, respectively. Molecular weights (MW) determined by SDS-PAGE-10% showed values of 44000 (Lc9) and 88000 (Lc13), while values of 550000 (Lc9) and 282000 (Lc13), were obtained by Superdex- 200 gel filtration. These estimated MW values suggested that both macromolecules in native state are multimeric proteins being formed by identical polypeptide chains. Different protein detections after SDS-PAGE of purified Lc9 and Lc13 showed that the majorimmune-revealed band correspond to the major coomassie brilliant blue R-350 revealed bands. So it concluded that both correspond to the main antigen present in each purified protein preparation (Lc9 and Lc13). For the development of an indirect ELISA for canine visceral leismaniosis diagnosis the antigens Lc9 and Lc13 as well IgG-peroxidase conjugate suitable concentrations were selected for the use in the related serologic assay. According to mentioned serologicalassay the antigen Lc9 gave better results than the antigen Lc13 (Lc9: sensitivity 100%; specificity 95% and Lc13: sensitivity 96%; specificity 92%). These results suggest the use of Lc9 and Lc13 antigens, preferably the former, in immune assays based on ELISA for the improvementof the leismaniasis diagnostic.
Keywords: Recombinant Proteins
Leishmania chagasi
Canine leishmaniasis
Dogs
Escherichia coli
keywords: Proteínas Recombinantes
Leishmania chagasi
Leishmaniose Canina
Cães
Escherichia coli
DeCS: Proteínas Recombinantes
Cães
Escherichia coli
Issue Date: 2009
Publisher: Instituto de Tecnologia em Imunobiológicos.
Citation: SOUZA, Cristiane Marques de. Isolamento, purificação e caracterização de duas proteínas recombinantes de leishmania chagasi,visando à padronização de um ensaio imunodiagnóstico para leishmaniose canina. 2009. 101 f. Dissertação (Mestrado Profissional em Tecnologia de Imunobiológicos) – Instituto de Tecnologia em Imunobiológicos, em parceria com o Instituto Oswaldo Cruz, Fundação Oswaldo Cruz, Rio de Janeiro, 2009.
Date of defense: 2009
Place of defense: Rio de Janeiro / RJ
Defense institution: Fundação Oswaldo Cruz. Instituto de Tecnologia em Imunobiológicos.
Program: Pós-graduação em Biologia Celular. Molecular eMestrado Profissional em Tecnologia de Imunobiológicos.
Copyright: open access
Appears in Collections:Biomanguinhos - Dissertações de Mestrado

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