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https://www.arca.fiocruz.br/handle/icict/64442
PROSPECÇÃO E CARACTERIZAÇÃO DE ANTICORPOS CONTRA FASCIOLA HEPATICA COM POTENCIAL DESENVOLVIMENTO PARA IMUNODIAGNÓSTICO
Ensaio de Imunoadsorção
Anticorpos Monoclonais
Anticorpos Policlonais
Pinto, Mariane Marques da Guarda | Date Issued:
2021
Advisor
Co-advisor
Affilliation
Fundação Oswaldo Cruz. Instituto Nacional de Infectologia Evandro Chagas. Rio de Janeiro, RJ, Brasil.
Abstract in Portuguese
A fasciolose é uma doença parasitária zoonótica de importância global. Doença negligenciada que ganhou atenção mundial nas últimas décadas, principalmente devido ao aumento da detecção de casos em humanos em diversos locais do mundo e por perdas econômicas na pecuária, alcançando bilhões por ano. No Brasil, a doença é endêmica em algumas regiões, como no Sul e Sudeste do país. Entretanto, como em outros países, ainda há uma lacuna em relação a verdadeira prevalência da Fasciola em animais, e principalmente em humanos. Havendo a necessidade de desenvolvimento e utilização de métodos de diagnósticos que sejam de fácil execução e possuam melhor custo-efetividade. Este estudo pretende produzir e caracterizar anticorpos monoclonais(mAbs) e policlonais(pAbs) com potencial para padronização de ensaios imunoenzimáticos de detecção de antígenos de F. hepatica. Para atingir tal objetivo, grupos de camundongos BALB/c foram imunizados com peptídeo predito in silico da proteína Catepsina L1 de Fasciola hepatica (PEPCL1Fh), Antígenos excretorsecretor de F. hepatica (AESFh) e Extrato total de F. hepatica (ETFh) para produção de mAbs. Os linfócitos foram fusionados com células de mieloma da linhagem Ag8XP3653 e os hibridomas obtidos, triados por ELISA indireto Os hibridomas positivos na triagem passaram por clonagem por citometria de fluxo (Single Cell Sorting), sendo selecionados por marcação os que produziram mAbs anti-PEPCL1Fh e os outros por morfologia e granulosidade, para obtenção dos mAbs. Do processo de fusão realizado, foram obtidos 44 hibridomas anti-ETFh, quatro anti-PEPCL1Fh e dois anti-AESFh. Para produção de pAbs, dois coelhos Nova Zelândia Brando foram inoculados com AESFh. Três anticorpos mAbs anti-ETFh (P1D5, P7C7 e P9B3), selecionados de processos de fusão distintas, e os anticorpos pAbs (C2) passaram por precipitação com sulfato de amônio, sendo utilizados na padronização do ensaio imunoenzimático (ELISA sanduíche). Apresentaram melhores resultados as combinações entre mAbs P1D5 ou P9B3 como anticorpo de captura e pAb C2 como anticorpo de detecção. O ensaio padronizado possui potencial para utilização na detecção de coproantígenos ou antígenos no soro. No entanto, os anticorpos produzidos neste estudo ainda precisam ser testados em experimentos subsequentes para confirmação da especificidade e sensibilidade em relação as amostras clínicas e caracterizados para que seja possível analisar as proteínas reconhecidos por todos os mAbs produzidos
Abstract
Fasciolosis is a zoonotic parasitic disease of global importance. A neglected disease that has gained worldwide attention in recent decades, mainly due to the increase in the detection of human cases in several parts of the world and due to economic losses in livestock, reaching billions per year. In Brazil, the disease is endemic in some regions, such as the South and Southeast of the country. However, as in other countries, there is still a gap regarding the true prevalence of Fasciola in animals, and especially in humans. There is a need to develop and use diagnostic methods that are easy to perform and have better cost-effectiveness. This study aims to produce and characterize monoclonal (mAbs) and polyclonal (pAbs) antibodies with potential for standardizing enzyme immunoassays for F. hepatica antigen detection. To achieve this objective, groups of BALB/c mice were immunized with Fasciola hepatica Cathepsin L1 protein predicted in silico peptide (PEPCL1Fh), F. hepatica excretory-secretory antigens (AESFh) and total F. hepatica extract (ETFh) for mAb production. Lymphocytes were fused with Ag8XP3653 myeloma cells and the hybridomas obtained were screened by indirect ELISA The hybridomas that were positive in the screening underwent cloning by flow cytometry (Single Cell Sorting), and those that produced anti-PEPCL1Fh mAbs were selected by labeling and the others by morphology and granularity, in order to obtain the mAbs. From the fusion process performed, 44 anti-ETFh, four anti-PEPCL1Fh and two anti-ESFh hybridomas were obtained. For production of pAbs, two New Zealand Bland rabbits were inoculated with hFSA. Three anti-ETFh mAbs (P1D5, P7C7 and P9B3), selected from different fusion processes, and pAbs antibodies (C2) underwent ammonium sulfate precipitation, being used in the standardization of the enzyme immunoassay (sandwich ELISA). The combinations between mAbs P1D5 or P9B3 as a capture antibody and pAb C2 as a detection antibody showed better results. The standardized assay has the potential for use in the detection of coproantigens or antigens in serum. However, the antibodies produced in this study still need to be tested in subsequent experiments to confirm the specificity and sensitivity in relation to clinical samples and characterized so that it is possible to analyze the proteins recognized by all mAbs produced
Keywords in Portuguese
Fasciola HepaticaEnsaio de Imunoadsorção
Anticorpos Monoclonais
Anticorpos Policlonais
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