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https://www.arca.fiocruz.br/handle/icict/65272
REFINAMENTO PARA OS ENSAIOS DE POTÊNCIA DE SORO ANTIDIFTÉRICO E COMPONENTE DIFTÉRICO EM VACINAS: ESTABELECIMENTO DE ESCORES CLÍNICOS PARA IMPLEMENTAÇÃO DE PONTO FINAL HUMANITÁRIO
Refinamento
Difteria
Desfecho humanitário
Ensaios de potência
Vacinas combinadas
Vacinas Bacterianas
Programa Nacional de Imunizações
Experimentação animal
Cavia porcellus
Controle de qualidade
Martins, Isadora Florentino | Date Issued:
2024
Author
Advisor
Co-advisor
Comittee Member
Affilliation
Fundação Oswaldo Cruz. Instituto Nacional de Controle de Qualidade em Saúde. Rio de Janeiro, RJ, Brasil.
Abstract in Portuguese
A Farmacopeia Brasileira ainda preconiza ensaios de letalidade para a determinação da potência do soro antidiftérico e do componente diftérico em vacinas combinadas. No entanto, ensaios de letalidade promovem intensa dor e sofrimento aos animais. O refinamento destes métodos pode ser obtido por meio da implementação de um desfecho humanitário, identificando parâmetros clínicos que assegurem que o animal atingiu o ponto final do ensaio, possibilitando a realização da eutanásia antes do agravamento dos sintomas. A nova abordagem deve garantir a correta identificação da eficácia dos produtos com base na potência obtida. Com o objetivo de refinar a metodologia de soroneutralização in vivo utilizada no INCQS, realizou-se o monitoramento de diversos parâmetros clínicos nas cobaias (Cavia porcellus) durante a realização de ensaios de rotina, para identificar as alterações clínicas mais promissoras para o estabelecimento de escores que possam ser utilizados na determinação do ponto final humanitário. Foram avaliados sinais clínicos associados à dor em outras espécies animais, evolução do peso e temperatura retal, desde o fornecimento dos animais até o término do ensaio ou óbito. Para a avaliação dos sinais clínicos foram elaborados escores: 0 (ausente/sem alteração); 1 (levemente presente ou alterado) e 2 (marcadamente presente ou alterado), além de registros em fotos e vídeos. Foram avaliadas 470 cobaias de 250-350g. Os animais foram classificados de acordo com o desfecho no ensaio de soroneutralização: vivo (Protegido; n=310), óbito (Não-protegido; n=144) e animais inoculados apenas com salina (controle negativo;n=16). Após análises estatísticas, parâmetros como contração do flanco, coloração e enrijecimento do abdômen, postura corporal/arqueamento do dorso, aspecto do nariz/parede lateral da cavidade oral e posicionamento de orelhas e vibrissas apresentaram uma eficácia limitada em identificar corretamente os animais que não sobreviveram aos ensaios. Os parâmetros que revelaram maior eficiência na previsão da letalidade dos animais considerados não protegidos nos referidos ensaios foram: redução do peso corporal, da temperatura retal, do grau de atividade na gaiola, do grau de abertura ocular e aspecto da pelagem (pelos arrepiados e desalinhados). Padrões de alterações faciais, comumente utilizadas em outras espécies, não foramobservadas nas cobaias expostas à toxina diftérica não-neutralizada. O modelo preliminar de predição, utilizando o compilado dos escores dos parâmetros significativos, também apresentou um bom desempenho, superando as previsões dos parâmetros isolados. O estudo destaca a viabilidade de diretrizes éticas para o uso de escores clínicos para determinação de um ponto final humanitário, em substituição ao desfecho baseado na letalidade, impactando positivamente no bem-estar animal em ensaios de potência in vivo para o controle da qualidade de vacinas contra difteria e soros antidiftéricos utilizados do Programa Nacional de Imunizações.
Abstract
Nowadays, the Brazilian Pharmacopoeia still recommends lethality as the endpoint for diphtheria antitoxin and diphtheria vaccine potency assays. However, lethality assays promote intense pain and distress in animals. The refinement of these methods can be achieved through the implementation of clinical scores as a humane endpoint, allowing euthanasia to be performed before symptoms worsen. The new approach must ensure the accurate identification of the effectiveness of products based on the final potency results. With the aim of refining the in vivo methodology used in INCQS, several clinical parameters were monitored in guinea pigs (Cavia porcellus) during routine tests. The goal was to identify the most promising clinical changes for establishing scores to determine a humane endpoint. Clinical signs associated with pain in other animal species, as well as changes in weight and rectal temperature, were evaluated from the time the animals were supplied until the conclusion of the test or the natural death of the animal. To assess clinical signs, scores were assigned as follows: 0 (absent/no change), 1 (slightly present or altered), and 2 (markedly present or altered). Additionally, photos and videos were recorded. A total of 470 guinea pigs, weighing between 250-350g, were included in the evaluation. The animals were categorized based on the serum neutralization assay outcomes: alive (protected; n=310), dead (non-protected; n=144), and animals inoculated only with saline as a negative control (n=16). After statistical analysis, parameters such as flank contraction, color and stiffness of the abdomen, body posture/arching of the back, cheek bulge, ear position, and whiskers change showed limited effectiveness in correctly identifying animals that did not survive the tests. The parameters that demonstrated greater efficiency in predicting the lethality of animals considered unprotected in the previously mentioned tests were: reduction in body weight and rectal temperature, degree of activity in the cage, orbital tightening, and appearance of the coat (with raised and scruffy hair). Patterns of facial changes, commonly observed in other species, were not detected in guinea pigs exposed to non-neutralized diphtheria toxin. The preliminary prediction model, employing the sum of scores from key parameters, outperformed predictions based on individual parameters. The study demonstrates the feasibility of ethical guidelines using clinical scores to establish a humane endpoint, replacing lethality-based outcomes. The new approach can positively impact animal welfare in the in vivo potency assays for quality control of diphtheria antitoxin and vaccines against diphtheria used in the Brazilian National Immunization Program
Keywords in Portuguese
Experimentação animalRefinamento
Difteria
Desfecho humanitário
Ensaios de potência
DeCS
DifteriaVacinas combinadas
Vacinas Bacterianas
Programa Nacional de Imunizações
Experimentação animal
Cavia porcellus
Controle de qualidade
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