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https://www.arca.fiocruz.br/handle/icict/66222
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ThesisCopyright
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- IFF - Teses de Doutorado [183]
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EDIÇÃO GÊNICA EM CÉLULAS TRONCO HEMATOPOÉTICAS PARA SÍNDROME DE WISKOTT-ALDRICH BASEADA NO SISTEMA CRISPR
CRISPR
Gene WAS
Terapia Genética
Reparo por Recombinação Homóloga
Genética
Terapia Genética
Reparo de DNA por Recombinação
Proteína 9 Associada à CRISPR
Sistemas CRISPR-Cas
Morais, Carla Cristina Pedrosa de Lira de | Date Issued:
2023
Co-advisor
Affilliation
Fundação Oswaldo Cruz. Instituto Nacional de Saúde da Mulher da Criança e do Adolescente Fernandes Figueira. Rio de Janeiro, RJ, Brasil.
Abstract in Portuguese
No campo da terapia gênica, as células-tronco hematopoiéticas (CTH) têm se tornado atrativas devido à sua capacidade de promover a hematopoiese por um longo período, oferecendo uma opção de tratamento para distúrbios do sistema hematopoiético, como os erros inatos da imunidade (EII). Vetores virais têm sido utilizados como estratégia de entrega de material genético para correção do gene causador da síndrome de Wiskott-Aldrich no entanto, a segurança desse método é questionável. Nesse contexto, o presente estudo propõe o sistema CRISPR/Cas9 como uma estratégia inovadora de terapia gênica para inserção e correção genética sítio-dirigida do gene WAS em CTH CD34+ purificadas de sangue de cordão umbilical humano. O RNAg desenhado apresentou uma eficácia de 93,3% em clivar o DNA no alvo. Apesar do pequeno número amostral, os resultados mostram edição gência utilizando doador linearizado para correção do gene WAS em CTH CD34+ expandidas com coquetel de citocinas e moléculas moduladoras de ciclagem celular tratadas com drogas estimuladoras de correção por recombinação homóloga. Embora a eficiência de correção gênica tenha se mostrado baixa < 1 %, os resultados confirmam a integração e estabilidade do DNA doador no alvo do genoma das células CD34+ . Assim, concluímos que o sistema CRISPR/cas9 é uma ferramenta promissora para edição genética sítio-dirigida no gene WAS, permitindo a criação de uma plataforma de estudos pré-clínicos onde estratégias de terapia gênica possam ser testadas em sua eficiência, segurança e estabilidade, imprescindíveis para o futuro no Brasil dessas terapias como estratégia curativa para doenças genéticas.
Abstract
In the field of gene therapy, hematopoietic stem cells (HSC) have become attractive due to their ability to promote hematopoiesis over a long period, offering a treatment option for disorders of the hematopoietic system, such as Inborn errors of immunity (IEI). Viral vectors have been used as a strategy for delivering genetic material to correct the gene that causes Wiskott-Aldrich syndrome; however, the safety of this method is questionable. In this context, the present study proposes the CRISPR/Cas9 system as an innovative gene therapy strategy for insertion and site-directed genetic correction of the WAS gene in CD34+ HSC purified from human umbilical cord blood. The designed gRNA showed a 93.3% efficiency in cleaving the DNA on target. Despite the small sample size, the results show gene editing using a linearized donor correction of the WAS gene in CD34+ HSC expanded with a cocktail of cytokines and cell cycling modulating molecules, treated with drugs that stimulate correction by homologous recombination. Although the gene correction efficiency was shown to be low < 1%, the results confirm the integration and stability of the donor DNA into the CD34+ cell genome target. Thus, we conclude that the CRISPR/cas9 system is a promising tool for site-directed gene editing in the WAS gene, which allows the creation of a platform for preclinical studies, where gene therapy strategies can be tested for their efficiency, safety and stability, essential for the future in Brazil of these therapies as a curative strategy for genetic diseases.
Keywords in Portuguese
Síndrome de Wiskott-AldrichCRISPR
Gene WAS
Terapia Genética
Reparo por Recombinação Homóloga
DeCS
Síndrome de Wiskott-AldrichGenética
Terapia Genética
Reparo de DNA por Recombinação
Proteína 9 Associada à CRISPR
Sistemas CRISPR-Cas
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