Uso da proteogenômica como abordagem metodológica para investigação de novos genes e variantes moleculares em modelos biológicos de importância médica

Abstract

A transcriptômica tem o sequenciamento em larga escala de moléculas de RNA (RNA-Seq) como o método mais utilizado atualmente para o estudo qualitativo e quantitativo dessa classe de moléculas. A proteômica tem a espectrometria de massas (MS) como principal ferramenta analítica, sendo mais frequentemente empregada na abordagem shotgun. A proteogenômica é a área de pesquisa que reúne dados dessas diferentes tecnologias para auxiliar na resolução de problemas biológicos e de bioinformática tais como a identificação de variantes de “splicing” alternativo e a anotação de genomas. Neste projeto, utilizamos a abordagem proteogenômica para: 1) Estudar variantes de “splicing” ortólogas em dados de MS de proteínas do cérebro de humano e camundongo; 2) Estudar o padrão de abundância e diversidade proteica em dados inéditos de MS de proteínas do córtex pré-frontal (CPF) e hipocampo (HPC) de um modelo de rato (ICV-STZ) da doença de Alzheimer (DA); 3) Estudar o padrão de expressão de transcritos e suas proteínas para aprimorar a anotação do genoma do nematoide Angiostrongylus costaricensis, causador da doença angiostrongilíase abdominal (AA). Para as análises de amostras de humano e camundongo, foi utilizado um banco de dados de sequências proteicas personalizado específico para cada espécie e dados públicos de MS de proteínas de duas regiões cerebrais: corpo caloso e bulbo olfatório. Seis variantes de “splicing” ortólogas foram identificadas e posteriormente confirmadas em dados públicos de RNA-Seq de camundongo e experimentalmente validadas por RT-qPCR. Duas dessas variantes, PKM1 e STXBP1a, também foram estimadas mais abundantes em um conjunto de dados públicos de MS de proteínas de um modelo murino (APP/PS1) da DA quando comparado com o seu controle (tipo selvagem) Esses resultados corroboram estudos anteriores que sugerem que essas variantes podem ter um papel na formação de agregados do tipo amiloide no cérebro, característica importante para a DA. Em seguida, um banco de dados de sequências proteicas personalizado de rato foi utilizado para a análise de dados inéditos de MS de proteínas das duas regiões cerebrais do modelo ICV-STZ. Como resultado, proteínas diferencialmente abundantes no CPF e HPC foram submetidas a uma análise de redes indicando uma grande participação de proteínas da membrana mitocondrial no estabelecimento da DA. O emprego de uma abordagem de proteogenômica para o aprimoramento da anotação do genoma de A. costaricensis utilizou dados inéditos de RNA-Seq para o alinhamento ao rascunho do genoma, servindo como evidência para predição de genes, variantes de “splicing” e variantes de nucleotídeo único (SNVs). A anotação de referência (WormBase) foi aprimorada com as novas predições, que passou a contar com 2.553 mRNAs de novos genes e 11.818 novas variantes de “splicing” e 350.292 SNVs. Os transcritos com quadro de leitura aberto (ORF) completos foram computacionalmente traduzidos e usados como banco de dados de sequências proteicas para análise dos dados de MS de proteínas. No total, 1.974 proteínas de novos genes, 402 novas proteoformas e 8.071 peptídeos contendo variantes de aminoácido único (SAAVs) foram identificados. Esperamos que o aprimoramento da anotação do genoma de A. costaricensis possa auxiliar futuros estudos que visem o diagnóstico e desenvolvimento de drogas para o tratamento da AA