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https://www.arca.fiocruz.br/handle/icict/68076
ESTUDO DAS CARACTERÍSTICAS MORFOFISIOLÓGICAS E DO POTENCIAL PATOGÊNICO DE ISOLADOS DE SPOROTHRIX SCHENCKII PRESERVADOS NA COLEÇÃO DE CULTURA DE FUNGOS FILAMENTOSOS DO INSTITUTO OSWALDO CRUZ
Sporothrix Schenckii Sensu Stricto
Coleção de Culturas de Fungos Filamentosos do Instituto Oswaldo Cruz
Óleo Mineral
Viabilidade
Taxonomia Polifásica
Locus Mating Type (MAT)
Sequenciamento Parcial de Genes
T3b Fingerprinting
Experimentação Animal
Sporothrix Schenckii Sensu Stricto
Collection of Cultures of Filamentous Fungi at Instituto Oswaldo Cruz
Mineral Oil
Viability
Polyphasic Taxonomy
Locus Mating Type (MAT)
Partial Gene Sequencing
T3b Fingerprinting
Animal Experimentation
Fisiopatologia
Sporothrix
Fisiologia
Patogenicidade
Isolamento e purificação
Técnicas de Genotipagem
Barreira, Thaís Guimarães | Date Issued:
2023
Author
Affilliation
Fundação Oswaldo Cruz. Instituto Nacional de Infectologia Evandro Chagas. Rio de Janeiro, RJ, Brasil.
Abstract in Portuguese
A esporotricose é a principal micose subcutânea no Brasil, causada por espécies do gênero Sporothrix e é considerada a maior epidemia por transmissão zoonótica em curso no mundo atualmente. A Coleção de Culturas de Fungos Filamentosos do Instituto Oswaldo Cruz (CCFF)/FIOCRUZ possui, dentre as diversas espécies preservadas, isolados identificados como Sporothrix schenckii, mantidos em preservação desde a década de 1920, antes da epidemia de esporotricose do Rio de Janeiro. Mas, a partir de 2007, baseados em estudos filogenéticos, foram descritas novas espécies patogênicas do gênero, fisiologicamente diferentes, inclusive no perfil de virulência. Dessa forma, os objetivos do estudo foram avaliar a viabilidade e a estabilidade in vitro do padrão morfofisiológico dos isolados de Sporothrix schenckii após preservação; autenticar as espécies utilizando taxonomia polifásica, identificar a presença do locus mating type (MAT) dos isolados e tentar correlacionar com a virulência das espécies autenticadas, utilizando modelo experimental murino. Para isso, foram avaliados 34 isolados mantidos na CCFF-IOC desde seu depósito, entre os anos de 1927 e 1965, preservados em meio batata dextrose agar (BDA) sob óleo mineral. A metodologia inicial deste estudo consistiu na retirada dos isolados do meio de preservação, seguida de subcultivo das amostras, para análise da viabilidade e características morfológicas e fisiológicas, tais como: estabilidade macro e micromorfológica; termoconversão; assimilação de carboidratos. A caracterização genotípica foi realizada por meio da extração de DNA e sequenciamento parcial de genes β-tubulina (BT2) e quitina sintase (CHS), bem como a caraterização pela metodologia do T3b fingerprinting e a identificação dos genes MAT1-1-1 ou MAT1-2-1 por PCR Para a análise da virulência dos isolados foram inoculados em camundongos BALB/c, os animais foram acompanhados quanto à evolução clínica da infecção/doença, taxa de mortalidade, índice esplênico, recuperação de células fúngicas e análise histopatológica. Como resultados, dos 34 isolados da CCFF, sete se mantiveram viáveis após longo tempo de preservação sob óleo mineral e apresentaram características morfofisiológicas compatíveis com o gênero Sporothrix. O sequenciamento parcial da BT2 e CHS de todos os isolados, identificaram-os como S. schenckii strito sensu e apresentaram variabilidade intraespecífica entre as espécies pela análise filogenética do BT2. A análise dos perfis de T3B de todos os isolados autenticaram as amostras na mesma espécie, a partir da avaliação do perfil de bandas de DNA. Concluímos, que nossos dados não mostraram correlação entre a identificação do locus MAT dos isolados S. schenckii sensu stricto com sua virulência. Além disso, foi possível inferir diferentes graus de virulência/patogenicidade entre os isolados e apontar a existência de variantes de S. schenckii sensu stricto com a virulência atenuada que podem oportunizar, com novas tecnologias, estudos que possam estar relacionados com a patogênese da esporotricose.
Abstract
Sporotrichosis is the main subcutaneous mycosis in Brazil, caused by species of the genus Sporothrix and it is, currently, considered the largest epidemic by zoonotic transmission in the world. The Cultures Collection of Filamentous Fungi at Instituto Oswaldo Cruz (CCFF)/FIOCRUZ has, among the various species preserved, isolates identified as Sporothrix schenckii, preserved since the 1920s, before the sporotrichosis epidemic in Rio de Janeiro. However, from 2007, based on phylogenetic studies, new pathogenic species of the genus were described, physiologically different, including the virulence profile. Thus, the objectives of the study were to evaluate the viability and in vitro stability of the morphophysiological pattern of Sporothrix schenckii isolates after preservation; authenticate the species using polyphasic taxonomy, identify the presence of the locus mating type (MAT) of the isolates and try to correlate with the virulence of the authenticated species, using a murine experimental model. For this, 34 isolates kept at the CCFF-IOC since its deposit, between the years 1927 and 1965, preserved in potato dextrose agar (PDA) medium under mineral oil were evaluated. The initial methodology of this study consisted of removing the isolates from the preservation medium, followed by subculture of the samples, for analysis of viability and morphological and physiological characteristics, such as: macro and micromorphological stability; thermoconversion; carbohydrate assimilation. Genotypic characterization was performed by DNA extraction, performing partial sequencing of β-tubulin (BT2) and chitin synthase (CHS) genes, as well as characterization by T3b fingerprinting methodology and identification of MAT1-1-1 or MAT1-2-1 genes by PCR For virulence analysis, the isolates were inoculated in BALB/c mice, subcutaneously, the animals were monitored regarding the clinical evolution of the infection/disease, mortality rate, splenic index, recovery of fungal cells and histopathological analysis. As a result, of the 34 CCFF isolates, seven remained viable after a long period of preservation under mineral oil and presented morphophysiological characteristics compatible with the genus Sporothrix. Partial BT2 and CHS sequencing of all isolates identified them as S. schenckii sensu strito and showed intraspecific variability between species by BT2 phylogenetic analysis. The analysis of the T3B profiles of all isolates authenticated the samples in the same species, based on the evaluation of the profile of DNA bands. The data showed that five of the seven isolates were of the MAT1-2 type, and only two were of the MAT1-1 type, suggesting heterothallism in this species. We also concluded that our data showed no correlation between the identification of the MAT locus of S. schenckii sensu stricto isolates with their virulence. In addition, it was possible to infer different degrees of virulence/pathogenicity among the isolates and point out the existence of variants of S. schenckii sensu stricto with attenuated virulence that may provide opportunities, with new technologies, for studies that may be related to the pathogenesis of sporotrichosis.
Keywords in Portuguese
EsporotricoseSporothrix Schenckii Sensu Stricto
Coleção de Culturas de Fungos Filamentosos do Instituto Oswaldo Cruz
Óleo Mineral
Viabilidade
Taxonomia Polifásica
Locus Mating Type (MAT)
Sequenciamento Parcial de Genes
T3b Fingerprinting
Experimentação Animal
Keywords
SporotrichosisSporothrix Schenckii Sensu Stricto
Collection of Cultures of Filamentous Fungi at Instituto Oswaldo Cruz
Mineral Oil
Viability
Polyphasic Taxonomy
Locus Mating Type (MAT)
Partial Gene Sequencing
T3b Fingerprinting
Animal Experimentation
DeCS
EsporotricoseFisiopatologia
Sporothrix
Fisiologia
Patogenicidade
Isolamento e purificação
Técnicas de Genotipagem
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