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SUBGENOMIC RNA DETECTION IN SARS-COV-2 ASSESSING REPLICATION AND INACTIVATION THROUGH SERIAL PASSAGES, RT-QPCR, AND ELECTRON MICROSCOPY
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Abstract in Portuguese
RNAs subgenômicos (sgRNAs) são marcadores potenciais de replicação ativa do SARS-CoV-2, servindo como moldes para a síntese de proteínas estruturais e acessórias em partículas virais infecciosas. Este estudo teve como objetivo usar RT-qPCR para quantificar sgRNA e intermediários de RNA negativo, avaliando a replicação viral em amostras de vírus inativadas por β-propiolactona (βPL). Vírus inativados submetidos a cinco passagens seriais cegas (BSs) foram amplificados por RT-qPCR usando primers para atingir o envelope (ENV) e nucleoproteínas (N1 e N2) de genes genômicos, RNA do envelope subgenômico (sgENV) e RNA do envelope intermediário (ENV-). Todos os controles positivos mostraram títulos virais consistentes entre as passagens (10 log10 cópias/mL em N1/N2 e 11 log10 cópias/mL em ENV) durante BSs. Amostras virais inativadas para alvos ENV e ENV- variaram de 11,34 log10 cópias/mL em BS1 a 11,20 log10 cópias/mL em BS5. O sgENV não foi mais detectado nas amostras inativadas de SARS-CoV-2 após a segunda passagem, sugerindo inativação bem-sucedida. A cinética de replicação mostrou perfis consistentes para alvos N1/N2, ENV e ENV- nas primeiras três horas pós-infecção (pih) e manteve aproximadamente 5 log10 cópias/mL em 1 pih, 2 pih e 3 pih. Um aumento exponencial acentuado no título viral foi observado de 24 pih em diante, atingindo o pico de 11,64 log10 cópias/mL em 48 pih. A microscopia eletrônica de transmissão confirmou partículas virais apenas em células infectadas com SARS-CoV-2 ativo. Esses resultados apoiam o uso do sgRNA como um marcador confiável para a replicação do SARS-CoV-2, especialmente na distinção entre replicação ativa e partículas não viáveis e no desenvolvimento de estratégias diagnósticas e terapêuticas.
Abstract
Subgenomic RNAs (sgRNAs) are potential markers of active SARS-CoV-2 replication, serving as templates for the synthesis of structural and accessory proteins in infectious viral particles. This study aimed to use RT-qPCR to quantify sgRNA and negative RNA intermediates, assessing viral replication in virus samples inactivated by β-propiolactone (βPL). Inactivated viruses subjected to five blind serial passages (BSs) were amplified by RT-qPCR using primers to target the envelope (ENV) and nucleoproteins (N1 and N2) of genomic genes, subgenomic envelope RNA (sgENV), and intermediate envelope RNA (ENV-). All positive controls showed consistent viral titers across passages (10 log10 copies/mL in N1/N2 and 11 log10 copies/mL in ENV) during BSs. Inactivated viral samples for ENV and ENV- targets ranged from 11.34 log10 copies/mL in BS1 to 11.20 log10 copies/mL in BS5. The sgENV was no longer detected in the inactivated SARS-CoV-2 samples after the second passage, suggesting successful inactivation. Replication kinetics showed consistent profiles for N1/N2, ENV, and ENV- targets in the first three post-infection hours (pih) and maintained approximately 5 log10 copies/mL at 1 pih, 2 pih, and 3 pih. A sharp exponential increase in the viral titer was observed from 24 pih onwards, peaking at 11.64 log10 copies/mL at 48 pih. Transmission electron microscopy confirmed viral
particles only in cells infected with active SARS-CoV-2. These results support the use of sgRNA as a reliable marker for SARS-CoV-2 replication, especially in distinguishing between active replication and non-viable particles and in the development of diagnostic and therapeutic strategies.
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