Detecção síncrona de patógenos humanos em metatranscriptomas de amostras ambientais

Abstract

A vigilância e descoberta de patógenos é um desafio devido à própria diversidade de patógenos e de espécies hospedeiras. As tecnologias de sequenciamento de alto desempenho têm se mostrado promissoras para o desenvolvimento de um único método que possa identificar patógenos de diversas origens em qualquer espécie hospedeira. Embora a metagenômica tenha sido amplamente utilizada nesses esforços, a eficácia desse método ainda apresenta limitações. Metodologias que utilizam como ferramenta a metatranscriptômica têm demonstrado resultados mais promissores. Neste trabalho testamos uma adaptação (a remoção de RNA ribossomal) em um protocolo de metatranscriptômica já descrito para avaliar a melhora na eficiência da captura de sequências de origem viral. Três estratégias de sequenciamento foram aplicadas em cinco diferentes amostras: sequenciamento de DNA, de mRNA e de RNA com depleção ribossomal. As bibliotecas foram sequenciadas gerando leituras pareadas de 100pb. Leituras de baixa qualidade e que mapearam contra os genomas de pombo e de humano foram removidas e as leituras foram classificadas quanto a sua distribuição taxonômica usando o Kraken2 resultando em classificações nos quatro domínios da biodiversidade. Para a validação dos resultados, leituras de patógenos de interesse com diferentes valores de leituras por milhão foram extraídas e mapeadas contra os respectivos genomas para estabelecer limiares de confiança identificando falso-positivos. Após essa validação, conseguimos identificar comemaior confiança potenciais espécies patogênicas de eucariotos, bactérias e vírus presentes nas amostras iniciais. Em seguida, aplicamos a estratégia de extração de RNA com depleção de RNA ribossomal em 14 novas amostras, ampliando a aplicação do método para um conjunto maior de amostras.