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Title: Avaliação da metodologia oficial in vivo e desenvolvimento de metodologia de inibição da citotoxicidade in vitro para determinação da potência do soro antibotrópico
Other Titles: Evaluation of the in vivo official methodology and development of an in vitro cytotoxicity inhibition methodology for potency determination of bothrops antivenom
Advisor: Delgado, Isabella Fernandes
Bourguignon, Saulo Cabral
Members of the board: Garcia, Elói de Souza
Gonzáles, Marcelo Salabert
Delgado, Isabella Fernandes
Authors: Araújo, Humberto Pinheiro de
Affilliation: Fundação Oswaldo Cruz. Instituto Nacional de Controle de Qualidade em Saúde. Rio de Janeiro, RJ, Brasil.
Abstract: Este estudo buscou fazer um diagnóstico da situação atual da determinação da potência do soro antibotrópico e anticrotálico no Brasil, assim como propor e avaliar materiais de referência e metodologias alternativas (potência relativa e inibição da citotoxicidade in vitro) à metodologia oficial, com o objetivo de melhor avaliar a qualidade do soro antibotrópico utilizado no Brasil. Entre os anos de 2000 e 2006 o INCQS analisou 619 lotes de soros antiofídicos. Neste período, oito lotes foram considerados insatisfatórios (1,29%). O desempenho dos Padrões de Referência foi avaliado pela determinação da repetibilidade e da reprodutibilidade através do Coeficiente de Variação (CV). A repetibilidade para o lote BRA/BOT/04 foi de 16,57%, para BRA/BOT/05 de 13,17%, para BRA/CROT/01 de 31,82% e para BRA/CROT/02 de 17,36%. Em um estudo interlaboratorial foi avaliada a reprodutibilidade da DL50 do lote BRA/BOT/05 (CV = 16,76%) e a repetibilidade, que variou entre 7,48% e 10,88% nos diferentes laboratórios. A correlação de Pearson entre as determinações da potência dos soros antibotrópicos feitas pelo INCQS e laboratórios produtores foi de 0,286 o que é considerada uma correlação regular, a correlação das determinações da potência dos soros anticrotálicos foi de 0,002 o que é considerado insatisfatório. Nenhum dos venenos de referência apresentou perda de potência significativa nas condições ideais de armazenamento, demonstrando a boa estabilidade destas preparações. O soro BRAantiBot/01 apresentou uma potência de 6,62 mg/mL, com CV de 11%. A correlação de Pearson entre os valores obtidos pelas metodologias de potência relativa e absoluta foi de 0,785, o que é considerado como uma boa correlação. Foi desenvolvida uma metodologia in vitro para a determinação da atividade citotóxica do veneno de B. jararaca e do soro antibotrópico em células VERO. Esta metodologia se propõe como uma alternativa ao ensaio de letalidade em camundongos, metodologia oficial vigente. O valor da DCt50 do veneno BRABOT/05 foi de 2,92 ug/mL. A precisão interensaios para as determinações da DL50 pelo método dose Citotóxica 50% in vivo apresentou um CV de 12,27% enquanto que para as determinações in vitro da DCt50 o CV foi de 7,19%. A correlação de Pearson entre os resultados obtidos pelas duas metodologias foi de 0,96, o que é considerado uma correlação excelente. A potência de BRAantiBOT/01 pelo método in vitro foi de 3.092,6 mg/mL. A repetibilidade apresentou um CV de 56,81%. Neste trabalho foi proposto que a potência do soro antibotrópico seja expressa em Unidades Neutralizantes (UN) e que cada UN corresponda à capacidade de 1 mL de soro antibotrópico neutralizar 1 mg de Veneno Botrópico de Referência.
Abstract: This study aims to make a diagnosis of the potency evaluation of bothropic and crotalic antivenoms in Brazil, as well as evaluate the performance of reference materials and alternatives (relative potency and in vitro cytotoxicity inhibition) to the pharmacopeic methods trying to improve the quality of antivenoms used in Brazil. Between 2000 and 2006, 619 lots of antivenoms were tested at INCQS. In this period, eight lots were unsatisfactory (1.29%). The Reference Standards performance was evaluated through the Coefficient of Variation (CV). The repeatability for the lot BRA/BOT/04 was 16.7%, for BRA/BOT/05 was 13.7%, for BRA/CROT/01 was 31.2% and for BRA/CROT/02 was 17.36%. The reproducibility for LD50 determinations of BRABOT/05 was evaluated through an interlaboratorial study and the CV was 16.76%, the repeatability varied between 7.48% and 10.88% in the participant laboratories. The correlation between the potency determinations for bothropic antiserum done by INCQS and manufacturers was 0.286, which is considered fair. The correlation for crotalic antiserum was 0.002 what is considered unsatisfactory. No one of the Reference Venoms lose potency significatively, giving evidence of a good stability profile in shelf conditions. The antiserum BRAantiBot/01 had a potency of 6.62 mg/mL, with a CV of 11%. The correlation between the values obtained through the methodologies of relative and absolute potency was 0.785, which is considered a good correlation. We also developed an in vitro methodology for the determination of the cytotoxic activity of B. jararaca venom and bothropic antivenom on VERO cells. This method is proposed as an alternative to the mice lethality test, the official methodology in vigour. The CtD50 of the reference venom BRABOT/05 was 2,92 ug/mL. The inter-assay precision for the LD50 (in vivo method) had a CV of 12.27%, while for the in vitro method (CtD50) the CV was 7.19%. The correlation between the results obtained by the two methods was 0.96, which is considered an excellent correlation. The potency of BRAantiBOT/01 obtained through the in vitro method was 3,092.6 mg/mL. The repeatability of this method has a CV of 56.81%. In this work, we propose that the bothropic antivenom potency should be expressed in Neutralizing Units (NU) and that each NU correspond to the ability of 1 mL of antivenom to neutralize 1 mg of Bothropic Reference Venom.
keywords: Soro Antibotrópico
Soro Anticrotálico
Determinação da Potência
Inibição da Citotoxicidade
DeCS: Antivenenos
Venenos de Crotalídeos
Estudos de Validação
Padrões de Referência
Vigilância Sanitária
Issue Date: 2008
Citation: ARAÚJO, H. P. Avaliação da metodologia oficial in vivo e desenvolvimento de metodologia de inibição da citotoxicidade in vitro para determinação da potência do soro antibotrópico. 2008. 199 f. Tese (Doutorado em Vigilância Sanitária) - Instituto Nacional de Controle de Qualidade em Saúde, Fundação Oswaldo Cruz, Rio de Janeiro, 2008.
Date of defense: 2008-04-29
Place of defense: Rio de Janeiro/RJ
Defense institution: Fundação Oswaldo Cruz. Instituto Nacional de Controle de Qualidade em Saúde
Program: Programa de Pós-Graduação em Vigilância Sanitária
Copyright: open access
Appears in Collections:INCQS - Teses de Doutorado

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