Comparação de testes fenotípicos x molecular para a detecção da beta lactamase AmpC em enterobactérias

Abstract

Infecções causadas por enterobactérias, são frequentemente relatadas em hospitalizações sendo responsáveis por diversas manifestações clínicas, com percentual de cepas multirresistentes aumentando com o passar dos anos conferindo diversos riscos ao paciente. A beta-lactamase AmpC confere resistência a diversos antibióticos beta-lactâmicos como penicilinas, cefalosporinas especialmente as de 2ª e 3ª geração e monobactâmicos, mas não hidrolisa o cefepime e antibióticos carbapenêmicos. Ela tem origem cromossômica, onde sua hiper-expressão pode ser induzida em algumas espécies de Enterobacteriaceae quando há exposição a cefalosporinas em cepas com mutações em seus genes reguladores. No entanto, a AmpC pode ser identificada em outras espécies sendo mediada por plasmídeos, onde sua expressão é contínua e abundante. O presente estudo teve como um dos objetivos identificar cepas de enterobactérias isoladas de amostras clínicas obtidas de hospitais e clínicas localizadas no município do Rio de Janeiro entre 2021 a 2024 e testar a sensibilidade destas aos antibióticos beta-lactâmicos com o VITEK-2 e antibiograma. De 148 isolados, foram identificadas 46 cepas resistentes a beta lactâmicos que foram submetidas a 2 testes de disco difusão para identificação de pAmpC, utilizando discos de cefoxitina e ceftazidima e compostos inibidores de AmpC, o ácido fenil borônico e cloxacilina. As cepas positivas foram submetidas a PCR convencional e sequenciamento de Sanger para identificação dos genes de pAmpC. Foram identificadas 3 cepas no total, sendo 2 Escherichia coli e 1 Klebsiella pneumoniae expressando os genes CMY-44, CMY-69 e ACT-5 sendo este o primeiro relato desses genes no Brasil. A variante CMY-44 confere resistência ao cefepime, o que difere do padrão esperado desse tipo de beta-lactamase, e o CMY-69 também pode conferir redução da sensibilidade ao cefepime pós exposição. Foram desenhados iniciadores específicos para a identificação desses genes na qPCR-HRM, e também para o blaCMY-2 onde foi utilizada a cepa de referência Salmonella enterica IAL 9722. Através de análises de qPCR-HRM foi determinada a TM ideal para a identificação dos genes. A realização dos testes fenotípicos possibilitou a comparação da assertividade e sensibilidade dos dois ensaios onde as cepas testadas mostraram maior sensibilidade à cloxacilina. No entanto, o teste molecular é indispensável na identificação dessa beta-lactamase. A análise genômica por WGS de 2 amostras, revelou dados significativos sobre a circulação de cepas carreando múltiplos genes de resistência a beta-lactâmicos de origem plasmidial. Também foi realizada a análise de MLST da cepa de K. pneumoniae blaACT-5 porém não foi possível determinar o complexo clonal nem o ST, mas foi possível afirmar que se trata de um novo ST pois não há nenhum perfil alélico similar no banco de dados. Além disso, até onde é do nosso conhecimento, essa é a primeira cepa descrita no Brasil carregando o gene ACT-5. A prevalência de cepas pAmpC observada nesse estudo foi de 6,52% naquelas com sensibilidade reduzida a beta-lactâmicos, sendo menos frequente que a prevalência de ESBL por exemplo, mas foi evidenciado a falta de estudos recentes sobre a prevalência de pAmpC em amostras clínicas no Brasil para o melhor monitoramento dessa beta-lactamase de interesse epidemiológico no país.