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https://www.arca.fiocruz.br/handle/icict/9560
ANÁLISE DE INNTERFERON HUMANO RECOMBINANTE PRESENTE EM FORMULAÇÕES FARMACÊUTICAS POR ESPECTROMETRIA DE MASSA
Andrade, Sinéa Mendes de | Date Issued:
2010
Alternative title
Analysis of recombinant human interferon in pharmaceutical formulations by mass spectrometryAuthor
Comittee Member
Affilliation
Fundação Oswaldo Cruz. Instituto Nacional de Controle de Qualidade em Saúde
Abstract in Portuguese
Os interferons (INFs) são proteínas produzidas por células animais em resposta a infecções virais. Essas substâncias possuem vários efeitos farmacológicos, incluindo antiviral, antitumoral e imunomodulatório. Com o advento da tecnologia do DNA recombinante, vários interferons passaram a ser produzidos e comercializados como Biofármacos. O mais importante é o α2b, que é uma das bases do tratamento das hepatites virais. A única norma oficial que regulamenta a produção de INF-α2b é a Farmacopéia Européia, sendo que restringe-se a matéria prima. O presente trabalho teve como objetivo desenvolver um protocolo para caracterizar a estrutura molecular do INF-α2b em formulações farmacêuticas por espectrometria de massa do tipo MALDI-TOF. Para a análise por MALDI-TOF foi necessário inicialmente desenvolver um método de cromatografia líquida para promover a separação entre o INF-α2b constituinte ativo e minoritário e o soro albumina humana, também componente presente nas formulações farmacêuticas. Primeiramente foi desenvolvido um procedimento baseado em imunoafinidade e cromatografia de gel filtração. As amostras preparadas dessa forma apresentaram homogeneidade protéica por eletroforese, sendo analisadas por dicroísmo circular e fluorescência, o que demonstrou ter ocorrido degradação da estrutura tridimensional. Adicionalmente, essas amostras não geraram espectros de massa. Foi desenvolvido então outro método de separação cromatográfica, baseado em fase reversa, obtendo-se amostras com homogeneidade protéica, revelada por eletroforese.
Abstract
Os interferons (INFs) são proteínas produzidas por células animais em resposta a infecções virais. Essas substâncias possuem vários efeitos farmacológicos, incluindo antiviral, antitumoral e imunomodulatório. Com o advento da tecnologia do DNA recombinante, vários interferons passaram a ser produzidos e comercializados como Biofármacos. O mais importante é o α2b, que é uma das bases do tratamento das hepatites virais. A única norma oficial que regulamenta a produção de INF-α2b é a Farmacopéia Européia, sendo que restringe-se a matéria prima. O presente trabalho teve como objetivo desenvolver um protocolo para caracterizar a estrutura molecular do INF-α2b em formulações farmacêuticas por espectrometria de massa do tipo MALDI-TOF. Para a análise por MALDI-TOF foi necessário inicialmente desenvolver um método de cromatografia líquida para promover a separação entre o INF-α2b constituinte ativo e minoritário e o soro albumina humana, também componente presente nas formulações farmacêuticas. Primeiramente foi desenvolvido um procedimento baseado em imunoafinidade e cromatografia de gel filtração. As amostras preparadas dessa forma apresentaram homogeneidade protéica por eletroforese, sendo analisadas por dicroísmo circular e fluorescência, o que demonstrou ter ocorrido degradação da estrutura tridimensional. Adicionalmente, essas amostras não geraram espectros de massa. Foi desenvolvido então outro método de separação cromatográfica, baseado em fase reversa, obtendo-se amostras com homogeneidade protéica, revelada por eletroforese. As amostras em solução foram submetidas à digestão com tripsina, levadas ao espectrômetro de massa MALDI-TOF, onde seus fragmentos trípticos foram identificados segundo a correlação entre os resultados encontrados a partir das amostras e do padrão de INF-α2 da Farmacopéia Européia submetido aos mesmos procedimentos. As coberturas de seqüência atingida no padrão foram de 72,7 % e para as amostras de 45,5 %. No produto comercial foi identificada uma ponte disulfeto. Esse trabalho fornece dados importantes que subsidiam o estabelecimento de um protocolo para a análise de INF-α2b em produto final, que poderia substituir o mapa de peptídeos tradicional por cromatografia líquida, com a vantagem de resultar em um maior número de informações sobre a estrutura molecular do biofármaco, importante para a ação farmacológica. Portanto, implementar o controle de qualidade e caracterização estrutural com a introdução de metodologias analíticas sensíveis de maneira que tenhamos informação acerca da segurança, qualidade e eficácia do biofármaco para o devido suporte para as ações de Vigilância Sanitária.
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