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Title: Caracterização fenotípica de fungos isolados na rotina do controle microbiológico de Bio-Manguinhos/FIOCRUZ e estruturação de uma micoteca
Advisor: Silva, Manuela da
Members of the board: Vieira, Verônica Viana
Moraes, Áurea Maria Lage de
Fraga, Marcelo Elias
Manuela da, Manuela da
Authors: Cruz, Fernanda Ventura
Affilliation: Fundação Oswaldo Cruz. Instituto Nacional de Controle de Qualidade em Saúde. Rio de Janeiro, RJ, Brasil.
Abstract: A indústria farmacêutica busca constantemente produzir e oferecer produtos com qualidade com o objetivo de garantir a eficácia do produto e a segurança do usuário. O regulamento que orienta as ações necessárias em todas as indústrias farmacêuticas do Brasil e trata das Boas Práticas de Fabricação de Medicamentos (BPF) é a RDC 17/2010. Segundo a Resolução, o monitoramento microbiológico de áreas controladas para produção de medicamentos deve ser realizado de modo que a contaminação ambiental seja evitada em todas as etapas de fabricação e, em caso de contaminação, que os micro-organismos isolados nesses ambientes sejam identificados, a fim de auxiliar a investigação da fonte de contaminação. A caracterização de fungos é extremamente importante para o conhecimento desta microbiota. Atualmente, a maioria dos métodos de identificação de micro-organismos utilizados nas indústrias farmacêuticas é baseada em provas bioquímicas (caracterização fenotípica), cujos sistemas são construídos com informações de isolados clínicos e não contemplam a diversidade ambiental. Não existem muitos relatos na literatura referentes aos contaminantes isolados em ambientes industriais. A identificação proteômica de micro-organismos por MALDI-TOF/MS apresenta-se inovadora por ser um método fácil, rápido, de alto rendimento e baixo custo. O objetivo do presente estudo foi caracterizar fenotipicamente por bioquímica e proteômica as leveduras e morfologicamente e por proteôomica os fungos filamentosos isolados nas áreas produtivas de Bio-Manguinhos/Fiocruz e implementar os métodos na rotina de identificação de contaminantes do Laboratório de Controle Microbiológico. Os isolados foram obtidos a partir de amostras de monitoramento ambiental, monitoramento de água, validação e testes de esterilidade. As leveduras foram identificadas pelo sistema bioquímico VITEK 2 Compact (V2) e proteômico VITEK MS RUO (VMS) e os fungos filamentosos foram caracterizados pela morfologia e pelo sistema VMS. Entre fevereiro de 2012 e novembro de 2013 foram isolados 514 fungos, sendo 453 (88%) fungos filamentosos e 61 (12%) leveduras. O sistema VMS apresentou melhor desempenho na identificação das leveduras de referência em comparação com o sistema V2. Na identificação dos isolados de leveduras autóctones, o sistema V2 apresentou maior número de identificações, em comparação com o sistema VMS, porém esse último teve maior diversidade de gêneros identificados. O gênero Candida foi o mais frequentemente identificado em ambas as metodologias. Os gêneros de fungos filamentosos identificados pela morfologia totalizaram 11, sendo Aspergillus o gênero encontrado com maior frequência (30% dos isolados), seguido pelos gêneros Penicillium (27%) e Cladosporium (23%). Foram selecionados 10 isolados autóctones da espécie A. versicolor para análise pelo VMS, juntamente com a cepa de referência A. versicolor INCQS 40028 (ATCC 16853), com tempo de crescimento de dois, três, quatro, cinco, seis e sete dias de incubação. Foi realizada a análise do BD/SARAMIS (BD) para todas leveduras que foram previamente identificados pela bioquímica e todos os fungos filamentosos previamente identificados pela morfologia. Com base nos resultados, constata-se a importância de inserir no BD os representantes fúngicos que não fazem parte deste banco, assim como os isolados não identificados, para ampliar a performance de identificação de espécies fúngicas. A implementação da metodologia de identificação morfológica dos fungos filamentosos em nível de gênero na rotina do laboratório foi concluída com êxito.
Abstract: The pharmaceutical industry constantly seeks to produce and deliver quality products in order to ensure the effectiveness of the product and user safety. The regulation that guides the actions required in all pharmaceutical industries in Brazil and deals with Good Pharmaceutical Manufacturing Practice (GMP) is the RDC 17/2010. According to the resolution, microbiological monitoring of controlled areas for the production of drugs should be performed so that environmental contamination is avoided at all stages of manufacture and in the event of contamination, the micro-organisms isolated in these environments are identified in orderto assist the investigation of the source of contamination. The characterization of fungi is extremely important for the knowledge of this microbial population. Currently, most of microorganisms identification methods used in the pharmaceutical industry is based on biochemical tests (phenotypic characterization), whose systems are built with information from clinical isolates and do not include environmental diversity. There are few reports in the literature regarding the isolated contaminants in industrial environments. The proteomic identification of microorganisms by MALDI-TOF/MS is regarded as innovative because it is an easy, quick, of high yield and low cost. The aim of this study was to characterize phenotypically by biochemistry and proteomics the yeasts and morphologically and by proteomics the filamentous fungi isolated from the productive areas of Bio-Manguinhos/Fiocruz and implement the methods in the contaminant identification routine of the Microbiological Control Laboratory. The isolates were obtained from samples of environmental monitoring, water monitoring, validating and sterility testing. The yeasts were identified by the biochemical system VITEK 2 Compact (V2) and by proteomic VITEM RUO MS (VMS) and the filamentous fungi were characterized by morphology and by VMS. Between February 2012 and November 2013, 514 fungi we isolated, from which 453 (88%) were filamentous fungi and 61 (12%) were yeasts. The VMS system was more efficient at identifying the reference yeasts compared to V2 system. For the identification of indigenous yeasts, the V2 system showed a higher number of identifications, compared to the VMS system, however the latter had greater diversity of genera identified. The genus Candida was the most frequently identified in both approaches. Filamentous fungal genera identified by morphology amounted 11, and the genus Aspergillus was the most frequently found (30% of isolates), followed by Penicillium (27%) and Cladosporium (23%). For VMS analyses, 10 indigenous isolates of A. versicolor were selected, along with the reference strain A. versicolor INCQS 40028 (ATCC 16853), with growth time of two, three, four, five, six and seven days of incubation. The BD/SARAMIS (BD) analyses were performed for all yeasts that were previously identified by biochemical tests and for all filamentous fungi previously identified by morphology. Based on the results, it was realized the importance of including in the BD fungal representatives that are not part of this database, as well as unidentified isolates, to increase the performance of fungal species identification. The implementation of morphological identification methodology of filamentous fungi at the genus level in the laboratory routine was successful.
Keywords: Controlled Areas
Environmental Monitoring
Filamentous Fungi
Yeasts
MALDI-TOF/MS
keywords: Áreas Controladas
Monitoramento Ambiental
Fungos Filamentos
Leveduras
MALDI-TOF/MS
DeCS: Monitoramento Ambiental
Fungos
Leveduras
Issue Date: 2015
Citation: CRUZ, F. V. Caracterização fenotípica de fungos isolados na rotina do controle microbiológico de Bio-Manguinhos/FIOCRUZ e estruturação de uma micoteca. 2015. 119 f. Dissertação (Mestrado em Vigilância Sanitária) -Instituto Nacional de Controle de Qualidade em Saúde, Fundação Oswaldo Cruz, Rio de Janeiro, 2015.
Date of defense: 2015-08-27
Place of defense: Rio de Janeiro/RJ
Department: Coordenação de Pós Graduação
Defense institution: Fundação Oswaldo Cruz. Instituto Nacional de Controle de Qualidade em Saúde
Program: Programa de Pós-Graduação em Vigilância Sanitária
Copyright: open access
Appears in Collections:INCQS - Dissertações de Mestrado

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